Pomozte vývoji webu a sdílení článku s přáteli!

PCR je test, který se používá při diagnostice mnoha onemocnění. Metoda PCR umožňuje prokázat přímou přítomnost bakterií v organismu, konkrétně jeho DNA. PCR se používá mimo jiné v v diagnostice lymské boreliózy. Co je to technika PCR? Co je to PCR v reálném čase?

Obsah:

  1. PCR (test) - jaká je technika PCR?
  2. PCR (test) - aplikace metody PCR
  3. PCR (test) - Lymeská borelióza
  4. PCR (test) - výsledky. Mohou být falešně pozitivní?
  5. PCR (test) - výsledky. Mohou být falešně negativní

PCR(polymerázová řetězová reakce) je primární metoda používaná v genetických a molekulárních laboratořích. Byl vyvinut v roce 1983 Kara Mullis, která za něj získala Nobelovu cenu v roce 1993.

PCR (test) - jaká je technika PCR?

PCR testspočívá v mnohonásobné amplifikaci (obvykle ve 30-40 cyklech) specifického fragmentu DNA, např. genů kódujících proteiny Borrelia, za použití enzymu polymerázy.

Poté se za účelem vizualizace amplifikovaného fragmentu DNA používají speciální molekulární barviva. PCR je díky amplifikaci specifických fragmentů DNA ultracitlivou metodou

V metodě PCR jsou fragmenty DNA amplifikovány pomocí specifických párů primerů pro danou oblast bakteriální DNA. Například cílové oblasti PCR používané při diagnostice lymské boreliózy jsou geny kódující proteiny, např. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.

Biologický materiál, ze kterého lze test provést, je:

  • krev
  • kožní řez z migrujícího erytému
  • mozkomíšní mok
  • synoviální nebo chrupavková tekutina
  • moč

PCR (test) - aplikace metody PCR

Kromě diagnózy lymské boreliózy dokáže metoda PCR detekovat specifické fragmenty DNA jiných mikroorganismů nebo člověka. Proto se metoda PCR používá také v:

  • diagnostika a sledování virových infekcí: herpes viry (herpes virus, herpes zoster, Epstein-Barr, cytomegalovirus), HIV, viry hepatitidy (HBV a HCV)
  • diagnostika a sledování bakteriálních infekcí, zejména těch bakterií,které nelze identifikovat pomocí kultur, např. tuberkulóza
  • diagnostika a sledování neoplastických onemocnění: leukémie, rakovina prsu, kolorektální rakovina, rakovina plic
  • diagnóza predispozice k rakovině: rakovina prsu a vaječníků (geny BRCA1 a BRCA2), kolorektální rakovina (geny APC a CHEK2)
  • diagnóza genetických onemocnění: hemochromatóza (gen HFE), talasémie (geny HBA1 a HBA2), celiakie (geny HLA)
  • testy otcovství, které zjišťují DNA kompatibilitu dítěte a otce
Stojí za to vědět

V současné době existuje mnoho modifikací metody PCR. Například v diagnostice lymské boreliózy se používají především metody nested PCR (nested PCR) a real-time PCR ( ). Tato metoda je kvantitativní a umožňuje určit přesný počet kopií DNA Borrelia v testovaném biologickém materiálu

PCR (test) a lymská borelióza

Základem diagnózy lymské boreliózy je sérologické vyšetření. Existují však klinické situace, které mohou způsobit, že tyto testy budou falešně negativní:

  • sérologické okno, tj. počáteční období infekce, ve kterém tělo ještě nevytváří specifické IgM a IgG protilátky proti boreliím
  • u imunokompromitovaných lidí, kteří neprodukují dostatek protilátek
  • přítomnost imunitních komplexů, které se skládají z boreliových antigenů a specifických protilátek k nim a brání detekci protilátek sérologickými metodami

Pokud je u pacienta podezření na příznaky lymské boreliózy a výsledky sérologického testu jsou negativní, lze provést molekulární test založený na metodě PCR.

DNA spirochet Borrelia lze detekovat v raných stádiích infekce, protože počet spirochet v tělesných tekutinách je tehdy nejvyšší.

V diagnostice lymské boreliózy se primárně používají sérologické metody jako ELISA, ale v některých klinických situacích je užitečné genetické testování pomocí metody PCR

Čím delší doba od infekce, tím nižší je pravděpodobnost detekce bakteriální DNA. Proto se v některých případech před provedením PCR testu bakterie pěstují na speciálním médiu po dobu 1-2 týdnů a poté se test provede.

Tento přístup se používá v případě podezření na Lymeskou boreliózu a odebraný mozkomíšní mok. V pozdní fázi infekce je vhodnější provést test ELISA

Metoda PCR by neměla být používána při rutinní diagnostice lymské boreliózy kvůli nedostatku standardizaceo výskytu odrůd Borrelia burgdorferi v Polsku

V případě obtíží s diagnózou (zejména v raném stadiu onemocnění) je však výsledek testu PCR nápomocný v diagnostickém procesu.

Pozitivní výsledek testu znamená, že v testovaném materiálu byla zjištěna přítomnost DNA Borrelia burgdorferi a jejích variant, ale nevysvětluje, zda je organismus aktivně infikován. Na druhou stranu negativní výsledek nevylučuje přítomnost bakterií v těle.

Některé laboratoře nabízejí testování na přítomnost DNA borelií v klíštěti. Výsledek takového testu však není základem pro diagnózu lymské boreliózy u kousnutého člověka

PCR - výsledky. Mohou být falešně pozitivní?

PCR je ultracitlivá metoda a zároveň velmi citlivá na kontaminaci. Proto je při testování na bázi PCR velmi důležité vybrat vhodnou vnitřní kontrolu, aby se vyloučily falešně pozitivní výsledky.

Klíčový význam má také správný odběr materiálu pro testy a také zkušenost a spolehlivost diagnostika provádějícího test.

PCR - výsledky. Mohou být falešně negativní

Jako u každého laboratorního testu, také u metody PCR se mohou objevit falešně negativní výsledky. Zde je zásadní odebrat krev pro vhodný antikoagulant, protože některé z nich, jako je heparin, mohou inhibovat PCR reakci.

Odběr materiálu po zahájení antibiotické terapie může snížit účinnost PCR reakce a zvýšit pravděpodobnost falešně negativních výsledků.

Je třeba také připomenout, že bakterie Borrelia žijí v krvi a tělesných tekutinách velmi krátkou dobu, protože díky speciálním receptorům velmi rychle pronikají do „těžko dostupných“ míst v těle.

Na rozdíl od diagnostiky jiných mikroorganismů je proto počet spirochet Borrelia v biologickém materiálu malý, někdy až na hranici detekce metodou PCR. To může také způsobit falešnou negativitu.

Reference

  1. Dunaj J. et al Význam metody PCR v diagnostice lymské boreliózy. Procházet Epidemiol. 2013, 67, 119–123.
  2. Laboratorní diagnostika nemocí přenášených klíšťaty Doporučení pracovní skupiny: Národní komora laboratorních diagnostiků, Státní zdravotní ústav-Národní hygienický ústav, Národní konzultant v oboru infekčních nemocí, Oddělení infekčních nemocí a neuroinfekcí , Lékařská univerzita v Białystoku, Polská virologická společnost, Varšava 2014.
  3. Ružić-Sabljić E. a Cerar T. Pokrok v molekulární diagnostice Lymeské boreliózy. Expert Rev Mol Diagn. 2022ledna; 17 (1): 19–30.
  4. Valones M.A.A. et al. Principy a aplikace polymerázové řetězové reakce v lékařských diagnostických oborech: přehled. Braz J Microbiol. 2009 leden-březen; 40 (1): 1–11.
O autoroviKarolina Karabin, MD, PhD, molekulární bioložka, laboratorní diagnostika, Cambridge Diagnostics PolskaProfesí biolog se specializací na mikrobiologii a laboratorní diagnostik s více než 10letou praxí v laboratorních pracích. Absolvent Vysoké školy molekulární medicíny a člen Polské společnosti humánní genetiky Vedoucí výzkumných grantů v Laboratoři molekulární diagnostiky na Klinice hematologie, onkologie a vnitřních nemocí Lékařské univerzity ve Varšavě. Titul doktora lékařských věd v oboru lékařská biologie obhájila na 1. lékařské fakultě Lékařské univerzity ve Varšavě. Autor mnoha vědeckých a populárně vědeckých prací z oblasti laboratorní diagnostiky, molekulární biologie a výživy. Denně jako specialista v oblasti laboratorní diagnostiky vede obsahové oddělení v Cambridge Diagnostics Polska a spolupracuje s týmem nutričních specialistů CD Dietary Clinic. Své praktické poznatky z diagnostiky a dietoterapie nemocí sdílí s odborníky na konferencích, školeních, v časopisech a na webových stránkách. Zajímá se zejména o vliv moderního životního stylu na molekulární procesy v těle.

Pomozte vývoji webu a sdílení článku s přáteli!

Kategorie:

Výzkum